Medienmitteilung der Universität Basel vom 18.10.2010

Forscher der Universität Basel haben eine Methode entwickelt, welche die genetische Modifikation von embryonalen Stammzellen aus Mäusen stark vereinfacht. Die Fachzeitschrift «Nature Methods» stellt die neue Technologie in ihrer aktuellen Ausgabe vor.

Um genetische Modifikationen auszulösen, verändern Forscher gezielt einen bestimmten Abschnitt des Erbgutes in embryonalen Stammzellen von Mäusen. Bei den herkömmlichen Techniken des Einführens eines modifizierten Abschnitts von DNS wird die veränderte Erbinformation allerdings nur sehr selten durch eine homologe Rekombination an der richtigen Stelle in das Erbgut der Wirtszelle eingebaut.

Neuere Verfahren wie das RMCE-Kassettenaustauschverfahren können modifizierte Gene wesentlich effizienter ins Erbgut von Säugerzellen einbringen. Allerdings müssen zuvor bestimmte, sogenannte heterotypische Erkennungssequenzen mithilfe der homologen Rekombination in das Zielgenom eingebracht werden. Diese markieren den Ort, an dem danach das massgeschneiderte Stück DNS eingefügt werden soll. Dieses Verfahren lässt sich aber nur in speziellen Fällen anwenden und insbesondere die vielen bereits modifizierten Mäusegene, bei denen sich Mutationen dank konditioneller Allele flexibel auslösen lassen, sind für dieses Austauschverfahren nicht geeignet.

Doppeltes Austauschverfahren

Forschern um Prof. Rolf Zeller vom Department Biomedizin der Universität Basel ist es nun gelungen, ohne die Hilfe der heterotypischen Erkennungssequenzen genetische Konstrukte ins Genom zu integrieren. Die als «Dual-RMCE» bezeichnete Technologie macht sich dabei mit FRT und LoxP zwei Erkennungssequenzen zunutze, die in den Tausenden von bereits vorhandenen konditionellen Allelen in Stammzellen von Mäusen vorhanden sind.

Mit diesem doppelten Austauschverfahren wird zunächst eine bestimmte Sequenz entfernt, um eine Andockstelle für den Vektor («Genfähre») zu schaffen, der im darauffolgenden Schritt das Konstrukt in die Erbinformation einschleust. Damit lassen sich alle diese Allele ohne erneute homologe Rekombination modifizieren. Zudem wird mit der neuen Methode die Frequenz drastisch gesteigert, mit der die neue Information korrekt in das Genom integriert wird.

Präzise Modifikationen

Die Dual-RMCE-Technologie erleichtert die präzise genetische Veränderung von embryonalen Stammzellen bei Mäusen, aus denen dann zum Beispiel durch in-vitro Differenzierung bestimmte Zelltypen gewonnen werden können. Diese Anwendungen sind für die Analyse der molekularen Grundlagen von Gewebedifferenzierung aus Stammzellen (Tissue Engineering) von grosser Bedeutung.

Mit dem Verfahren lassen sich aber auch krankheitserzeugende Mutationen in embryonale Stammzellen einführen und präzise Mausmodelle für menschliche Erkrankungen schaffen – zum Beispiel für die Erforschung von Tumoren oder degenerative Erkrankungen.

Schliesslich können Forscher mit der Dual-RMCE-Methode auch Proteine markieren, was es erlaubt, ihre Interaktionen und Funktionen im lebenden Organismus zu studieren – und dies viel genauer und mit weniger Aufwand als bisher.

Zum Patent angemeldet

Die von den Basler Forschern entwickelte Technologie hat grosses Potential sowohl für die Grundlagen- als auch für die angewandte Forschung. Deshalb hat die Universität Basel die Dual-RMCE-Technologie zum Patent angemeldet.

Originalbeitrag:
Marco Osterwalder, Antonella Galli, Barry Rosen, William C Skarnes, Rolf Zeller & Javier Lopez-Rios
Dual RMCE for efficient re-engineering of mouse mutant alleles
Nature Methods, Published online 17 October 2010 | doi: 10.1038/nmeth.1521

Externer Link: www.unibas.ch

Pressemitteilung der Universität Heidelberg vom 07.10.2010

Heidelberger Wissenschaftler entdecken ähnliche Mechanismen wie beim Menschen

Mit einem ähnlichen Mechanismus sorgen bestimmte Gene bei Pflanzen und beim Menschen dafür, dass Zellen Informationen über ihr genetisches Schicksal an ihre Tochterzellen weitergeben können. Diese überraschende Entdeckung haben Biologen der Universität Heidelberg bei Untersuchungen an der molekularbiologischen „Modellpflanze“ Ackerschmalwand aus der Familie der Kreuzblütler gemacht. Danach gibt es strukturelle Ähnlichkeiten zwischen zwei pflanzlichen Proteinen und einem menschlichen Protein, das beim sogenannten Zellgedächtnis mitwirkt. Damit kam das Forscherteam unter Leitung von Dr. Myriam Calonje zu neuen Erkenntnissen darüber, wie in wachsenden Geweben die Informationen über das spezifische Gen-Programm an die neuen Zellgenerationen weitergegeben werden. Die Ergebnisse werden in der Zeitschrift „Current Biology“ veröffentlicht.

Ausgangspunkt der Untersuchungen war die Entdeckung einer Pflanze der Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana), bei der die Funktionen des zellulären Gedächtnisses gestört waren: Die Pflanze wies eine große Zahl von Abweichungen auf, unter anderem verwandelten sich bereits kurz nach der Keimung einzelne Bereiche der Keimblätter wieder in embryoartige Strukturen zurück. Mit molekulargenetischen Untersuchungen konnten die Wissenschaftler zeigen, dass es sich dabei um sogenannte somatische Embryonen handelt, also Embryonen, die von bereits differenzierten Zellen gebildet werden. Damit wird den Tochterzellen das Schicksal der vorhergehenden Zellgeneration nicht mitgeteilt und sie starten noch einmal mit dem Entwicklungsprogramm.

Die Heidelberger Forscher konnten zwei Gene ausmachen, deren Defekt für diese Störung verantwortlich ist. Dabei kodieren diese beiden Gene zwei Proteine, die strukturelle Ähnlichkeiten aufweisen mit dem humanen BMI1-Protein. Dieses Protein ist Teil eines molekularen Mechanismus, der als zelluläres Gedächtnis bezeichnet wird. „Die Mechanismen des Zellgedächtnisses der Ackerschmalwand sind denen des Menschen sehr ähnlich, auch wenn ein Teil der beteiligten Gene im Verlauf der Evolution ausgetauscht wurde“, erläutert Dr. Calonje.

Kooperationspartner in Madrid haben nachgewiesen, dass das pflanzliche BMI1-Protein wie sein humaner Verwandter ebenfalls wichtige Komponenten der Erbsubstanz – sogenannte Histone – chemisch markiert. Dies hat zur Folge, dass das Gen von einem bestimmten Zeitpunkt an „abgeschaltet“ ist. Diese spezielle Markierung kann ohne Veränderung des DNA-Codes an die durch Zellteilung entstandenen Tochterzellen weitervererbt werden. Das bedeutet, dass die bei Arabidopsis gefundenen Gene es den Zellen ermöglichen, die Information über ihr genetisches Schicksal an die nächste Zellgeneration weiterzugeben.

Originalveröffentlichung:
Bratzel et al.: Keeping Cell Identity in Arabidopsis Requires PRC1 RING-Finger Homologs that Catalyze H2A Monoubiquitination, Current Biology (2010), doi:10.1016/j.cub.2010.09.046

Externer Link: www.uni-heidelberg.de

Pressemeldung der Universität Erlangen-Nürnberg vom 07.10.2010

FAU-Forscher untersucht Lebensvielfalt in sauren Seen

Fische können darin kaum überleben, Menschen bekämen Hautverätzungen – das „Restloch“ RL107 in der Lausitz und der Lindensee in der Oberpfalz sind so sauer wie reiner Essig. Es gibt allerdings Lebensformen die sich darin wohlfühlen: säuretolerante Mikroorganismen, die Dr. Volker Huß vom Lehrstuhl für Molekulare Pflanzenphysiologie der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU) im Rahmen eines Forschungsprojekts der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) untersucht hat. Durch die Isolierung spezieller DNA-Abschnitte, so genannter ribosomaler RNA, erfasste und kategorisierte er die einzelnen, dort existierenden Organismen und entdeckte unter anderem einen bislang völlig unbekannten Mikroorganismus.

Die Gewässer sind Überreste des Braunkohletagebaus, ehemalige Lagerstätten, die im Laufe der Zeit überschwemmt oder geflutet wurden und in denen Pyrit – ein bei der Lagerung von Braunkohle entstehendes Mineral – von Mikroorganismen zersetzt wird. Bei diesem Prozess entsteht Schwefelsäure, die die Gewässer so sauer macht.

Ingesamt 23 verschiedene Mikroorganismen isolierte Huß aus dem Lindensee. Im „Restloch“, das einen noch höheren Säuregehalt aufweist, konnte er nur noch neun verschiedene Organismen identifizieren. In einem Verfahren, das als „environmental PCR“ bezeichnet wird, extrahierte der Wissenschaftler die in Wasserproben vorhandenen unterschiedlichen RNA-Sequenzen und verglich sie anschließend mit einer Datenbank, in der tausende weitere solche Sequenzen gespeichert sind. „Dabei hat sich gezeigt, dass die uns bekannten und charakterisierten Organismen nur einen Bruchteil der natürlich vorkommenden Biodiversität ausmachen“, erläutert Huß das Forschungsergebnis. Eine der gefundenen Sequenzen konnte sogar keiner der bislang bekannten Evolutionslinien der Organismen zugeordnet werden.

Die ribosomale RNA eignet sich besonders gut zur Identifizierung verschiedener Organismen, da sie sich im Laufe der Evolution nur geringfügig verändert hat. Je ähnlicher die RNA-Sequenzen sind, desto später haben sich die Organismen in der Evolution voneinander abgespalten. „Über die Sequenzen lässt sich ermitteln, wann sich die Entwicklungslinien getrennt haben. Vergleicht man sie dann miteinander, entsteht eine Art Familienstammbaum, der uns zeigt, was für eine ungeheure Vielfalt dieser Mikroorganismen existiert“, sagt Dr. Huß. „Mit anderen Untersuchungsmethoden, wie z.B. mit einem Mikroskop, wäre eine exakte Bestimmung wesentlich schwieriger oder gar unmöglich.“

Auch bereits bekannte Organismen unterzog Dr. Huß einer eingehenden Untersuchung. Bei der elektronenmikroskopischen Analyse einer aus den Seen isolierten Grünalge machte er eine weitere Entdeckung. Manche Gruppen von Algen besitzen einen Schutzmechanismus. Ähnlich wie Igel rollen sie sich bei äußeren Einflüssen, die sie schädigen könnten, zusammen zu Kugeln, so genannten Cysten. Auf diese Weise können sie jahrelang auch unter widrigsten Bedingungen überleben. Ein derartiger Mechanismus ist innerhalb der Gruppe von Grünalgen, zu denen die von Dr. Huß erfasste Alge gehört, nicht bekannt. Diese Alge bildet aber cystenähnliche Strukturen aus, die möglicherweise als Vorstufen der Evolution zu einer echten Cystenbildung angesehen werden können.

Langfristig gesehen könnte die Untersuchung der säuretoleranten Mikroorganismen in der Biotechnologie genutzt werden. Denkbar wäre ein Einsatz zum Beispiel in der biologischen Abwasserreinigung.

Dr. Volker Huß gilt als Experte bei der phylogenetischen Bearbeitung von Mikroalgen, also der Analyse ihrer Stammbäume. Bislang gab es nur eine einzige vergleichbare Untersuchung der Biodiversität eines derart sauren Biotops, in einem spanischen Fluss, der ebenfalls einen extrem hohen Säuregehalt aufweist.

Externer Link: www.uni-erlangen.de

Presseinformation der LMU München vom 24.09.2010

Neue Einblicke in die Funktion basophiler Granulozyten

Sie sind so etwas wie das „hässliche Entlein“ des Immunsystems: Basophile Granulozyten kommen relativ selten vor und wurden von der Forschung bis vor wenigen Jahren kaum beachtet. Doch in Wirklichkeit erfüllen diese weißen Blutkörperchen eine wichtige Funktion bei der Abwehr von Krankheitserregern, wie ein Forscherteam um den LMU-Immunologen Dr. David Vöhringer nun zeigen konnte. Die Forscher haben ein Mausmodell entwickelt, dem die basophilen Granulozyten fehlen. Damit lässt sich erstmals gezielt untersuchen, ob diese Blutkörperchen an bestimmten Immunreaktionen beteiligt sind oder nicht. „Auf diese Weise konnten wir schon jetzt einige der bisher vermuteten Funktionen der basophilen Granulozyten bestätigen und andere widerlegen“, sagt Christian Schwartz, der maßgeblich an der Studie beteiligt war. „So sind die Basophilen wichtig, um eine Wiederinfektion mit parasitischen Würmern zu verhindern, und sie spielen auch bei der allergischen Dermatitis, einer chronischen Hautentzündung, eine entscheidende Rolle.“ Das innovative Mausmodell könnte künftig dazu beitragen, die Rolle der basophilen Granulozyten sehr detailliert zu untersuchen und möglicherweise neue Behandlungsstrategien zu entwickeln. (Immunity online, 24. September 2010)

Die Leukozyten oder weißen Blutkörperchen umfassen verschiedene Zelltypen, wobei die aus dem Knochenmark stammenden basophilen Granulozyten nicht einmal zwei Prozent ausmachen und damit am seltensten vorkommen. Ihre Funktion war bislang weitgehend unklar. Es gab allerdings Anhaltspunkte, dass sie bei der allergischen Dermatitis, einer chronischen Entzündung der Haut, und bei der akuten immunologischen Überreaktion einer Anaphylaxie von Bedeutung sind. Auch mit sogenannten Th2-Immunantworten wurden basophile Granulozyten in Verbindung gebracht.

Nun hat ein Forscherteam um Privatdozent Dr. David Vöhringer vom Institut für Immunologie der LMU München erstmals ein Mausmodell entwickelt, mit dessen Hilfe sich die Funktionen der basophilen Granulozyten bei verschiedenen Immunantworten gezielt untersuchen lassen. Dazu veränderten die Wissenschaftler das spezifisch in basophilen Granulozyten aktive Gen Mctp8 und erzeugten auf diese Weise Mäuse, denen diese weißen Blutkörperchen fehlen. Mithilfe des Modells konnten die Immunologen erstmals die Rolle der basophilen Granulozyten bei der Abwehr verschiedener Krankheitserreger und der Entstehung allergischer Reaktionen unter die Lupe nehmen.

„Dabei haben wir festgestellt, dass diese Blutkörperchen tatsächlich mit Th2-Immunantworten assoziiert sind, aber nicht entscheidend an deren Induktion“, berichtet Christian Schwartz. „Das sind Abwehrreaktionen, an denen T-Helferzellen vom Typ 2 beteiligt sind. Hierbei sind die basophilen Granulozyten für die Abwehr von Wurminfektionen wichtig, vor allem schützen sie vor einem wiederholten Parasitenbefall.“ Diese Immunzellen tragen zur Entstehung der chronischen allergischen Dermatitis bei, sind aber nicht an der Anaphylaxie beteiligt. Bei dieser allergischen Überreaktion des Immunsystems kommt es nach Kontakt mit dem Allergen in der Folge zu einer Erweiterung der Blutgefäße, was einen starken Abfall des Blutdrucks bis hin zum tödlichen Kreislaufversagen bewirken kann.

Das neue Mausmodell könnte auch künftig helfen, die Rolle der basophilen Granulozyten an verschiedenen Immunantworten aufzuklären und Regulierungsprozesse genauer zu verstehen, an denen die Blutkörperchen beteiligt sind. „Entsprechende Projekte planen wir bereits“, so Vöhringer. „Zunächst müssen wir aber die Funktionen dieser bislang weitgehend unbekannten Zellen im Detail entschlüsseln. Diese Erkenntnisse, etwa zur Beteiligung der Basophilen an allergischen Reaktionen, könnten in Zukunft auch zu neuartigen Behandlungsstrategien führen.“ (CA/suwe)

Publikation:
„Basophils Orchestrate Chronic Allergic Dermatitis and Protective Immunity against Helminths“;
Caspar Ohnmacht, Christian Schwartz, Marc Panzer, Isabell Schiedewitz, Ronald Naumann, David Voehringer;
Immunity, Band 33, S. 1-11
24. September 2010
DOI: 10.1016/j.immuni.2010.08.011

Externer Link: www.uni-muenchen.de