Wie Schalter in Bakterien funktionieren

Presseinformation des KIT (Karlsruher Institut für Technologie) vom 25.09.2017

Forscher des KIT, der Universität Heidelberg und der Freien Universität Berlin analysieren Struktur und Dynamik von Riboschaltern in lichtoptischen Einzelmolekülexperimenten

Viele Bakterien besitzen molekulare Kontrollelemente, über die sie Gene an- und abschalten können. Diese Riboschalter eröffnen neue Möglichkeiten bei der Entwicklung von Antibiotika oder auch zum Aufspüren und Abbauen von Umweltgiften. Wie die Riboschalter funktionieren, haben Forscher des Karlsruher Instituts für Technologie (KIT), der Universität Heidelberg und der Freien Universität Berlin nun anhand von lichtoptischer Mikroskopie an Einzelmolekülen grundlegend untersucht. Darüber berichten sie in der Zeitschrift Nature Chemical Biology. (DOI: 10.1038/nchembio.2476)

Riboschalter (Riboswitches) liegen auf der Boten-Ribonukleinsäure (mRNA), die genetische Information zum Ort der Proteinbiosynthese transportiert. Ein Riboschalter besteht aus einem Sensor, der die Konzentration eines kleinen Stoffwechselmoleküls misst, und einem Effektor, der die Genexpression und damit die Synthese eines Proteins steuert. Weil Riboschalter in vielen bakteriellen Krankheitserregern vorkommen, stellen sie bei der Entwicklung neuer Antibiotika wichtige Angriffsziele dar. Weitere Anwendungen eröffnen sie in der synthetischen Biologie. Zum Beispiel lassen sich Bakterien mit Riboschaltern gentechnisch so modifizieren, dass sie niedermolekulare Umweltgifte, wie Herbizide, aufspüren und abbauen können. Voraussetzung ist allerdings ein grundlegendes Verständnis der Prozesse, auf denen die Funktion der Riboswitches beruht. Dazu trägt die nun im Magazin Nature Chemical Biology vorgestellte Arbeit wesentlich bei.

Die von der Heidelberg Karlsruhe Research Partnership (HEiKA) geförderte Arbeit entstand in Kooperation der Forschergruppen um Professor Gerd Ulrich Nienhaus am Institut für Angewandte Physik (APH), Institut für Nanotechnologie (INT) und Institut für Toxikologie und Genetik (ITG) des KIT sowie um Professor Andres Jäschke am Institut für Pharmazie und Molekulare Biotechnologie (IPMB) der Universität Heidelberg. Im Fokus der Arbeit steht der S-Adenosyl-L-Methionin (SAM)-I Riboschalter. „Bei diesem Riboschalter bewirkt die Anbindung des SAM-Moleküls, dass sich die Konformation, das heißt die räumliche Anordnung der Atome, von der Antiterminator (AT)-Struktur zur Terminator (T)-Struktur hin verändert“, erklärt Nienhaus. „Dadurch wird die Genexpression abgeschaltet.“

Zunächst synthetisierten die Wissenschaftler in Heidelberg die SAM-I Riboschalter und markierten sie an verschiedenen Stellen gezielt mit je zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen. Die Forscher am KIT untersuchten diese RNA-Moleküle dann in hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung mit höchst sensitiven Lichtmikroskopen, welche die Fluoreszenzemission einzelner Farbstoffmoleküle registrierten. In Förster-Resonanzenergietransfer-Experimenten (FRET) ließ sich die Konformationsdynamik direkt erfassen: Ein grüner Farbstoff wird dazu mit Laserlicht zur Lichtemission angeregt. Befindet sich in der Nähe ein roter Farbstoff, kann dieser die Anregungsenergie des grünen Farbstoffs übernehmen und selbst Licht aussenden. Die Wahrscheinlichkeit, dass ein Energietransfer stattfindet, ist stark abhängig vom Abstand der Farbstoffe zueinander, sodass sich Strukturänderungen eines Moleküls, an das die Farbstoffe gezielt angebracht sind, direkt über die Emission des roten Farbstoffs beobachten lassen. Da die Lichtemission extrem schwach ist, bedurfte es aufwendiger Datenanalyseverfahren, basierend auf Hidden Markov Modeling. Professorin Bettina Keller vom Institut für Chemie und Biochemie der Freien Universität Berlin entwickelte die Verfahren speziell für diese Art von Experimenten, um die zeitabhängigen Lichtemissionssignale aus dem Rauschen herauszuheben.

Bei der Analyse gelang es den Forschern, nicht nur zwei Konformationen (T und AT) des SAM-I Riboschalters zu unterscheiden, sondern insgesamt vier (T1, T2, AT1 und AT2). Überraschend war auch, dass der Riboschalter in An- und Abwesenheit von SAM nicht, wie eigentlich zu erwarten war, vollständig zwischen T- und AT-Strukturen hin und her schaltete, sondern ständig zwischen allen Zuständen hin und her fluktuierte; lediglich deren Gewichtungen waren verschoben. Ein für die biologische Funktion besonders wichtiges Ergebnis war, dass die beobachteten Strukturfluktuationen mit angedocktem SAM deutlich schneller waren als ohne SAM. Da die Riboschalter-Sequenz auf der Boten-RNA direkt vor dem zu steuernden Gen liegt, muss das RNA-Molekül nach der Synthese – bei Anwesenheit von SAM – schnellstmöglich eine T-Struktur (Schalter aus) einstellen können, um die anschließende Transkription des zu steuernden Gens zu verhindern. Die Beschleunigung der Strukturfluktuationen durch SAM-Bindung stellt demnach sicher, dass die T-Struktur schnell genug eingestellt werden kann. „Mithin spielt die Dynamik des SAM-I Riboschalters eine entscheidende Rolle für seine Funktion“, resümiert Nienhaus vom KIT. „Diese detaillierten Einblicke in die Funktionsweise eines Biomoleküls verdanken wir einem fächerübergreifenden Forschungsansatz mit Beiträgen aus der Physik, der Biotechnologie und der theoretischen Chemie.“ (or)

Publikation:
Christoph Manz, Andrei Yu Kobitski, Ayan Samanta, Bettina G Keller, Andres Jäschke & G Ulrich Nienhaus: Single-molecule FRET reveals the energy landscape of the full-length SAM-I riboswitch. Nature Chemical Biology (2017). DOI: 10.1038/nchembio.2476

Externer Link: www.kit.edu

Bakterielle Nano-Harpune funktioniert wie Power-Bohrer

Medienmitteilung der Universität Basel vom 25.09.2017

Um sich unliebsamer Konkurrenten zu entledigen, bedienen sich einige Bakterien einer ausgeklügelten Waffe – der Nanoharpune. Forscher vom Biozentrum der Universität Basel haben nun ganz neue Einblicke in deren Bau, die Funktionsweise sowie das Recycling gewonnen. Wie sie im Fachblatt «Nature Microbiology» berichten, bohrt sich die Nanoharpune in wenigen Tausendstelsekunden in die Zellwand der Nachbarzelle und injiziert dort einen Giftcocktail.

Dicht an dicht drängeln sich Millionen winziger Mikroben auf Blättern, Steinen oder unserer Haut. Und beinahe überall müssen sie um Ressourcen und Nährstoffe wetteifern. Im Laufe der Evolution haben daher einige Bakterien eine Waffe entwickelt, mit der sie ihren Konkurrenten und Gegnern in der Umgebung einen Giftcocktail injizieren und sie so ausschalten. In der Fachwelt wird dieser einer Harpune ähnelnden Waffe auch als Typ 6 Sekretionssystem (T6SS) bezeichnet.

Bereits vor zwei Jahren gelang es Prof. Marek Basler den atomaren Aufbau der Nanoharpune im «abgefeuerten» Zustand aufzuklären. In der aktuellen Studie, die in Zusammenarbeit mit verschiedenen Forschungsgruppen und Technologieplattformen am Biozentrum entstand, legte das Team nun erstmals die Struktur der Nanoharpune im «abschussbereiten» Zustand offen. Anhand dieser Erkenntnisse konnten die Forscher nun zeigen, wie die T6SS-Harpune im Detail funktioniert.

Struktur der Nanoharpune verändert sich beim Abfeuern

Die Harpune ist aus verschiedenen Bauteilen aufgebaut, dazu gehören eine äussere Hülle und ein Speer mit einer scharfen Spitze. Die Hülle selbst besteht aus über 200 zahnradartigen Proteinringen, die sich um den starren Speer herumwinden. Beim Abfeuern des T6SS zieht sich die Hülle zusammen und stösst dabei den Giftspeer aus der Zelle heraus. Dieser dringt in die benachbarten Zellen ein und setzt dort tödliche Toxine frei. «Bis jetzt gab es nur Vermutungen darüber, wie sich die Struktur der T6SS-Hülle bei der Kontraktion verändert», sagt Basler. «Mithilfe der Kryo-Elektronenmikroskopie, die am C-CINA durchgeführt wurde, erhielten wir nun erstmals von der gedehnten Hüllstruktur ein Bild in atomarer Auflösung.»

Durch den Vergleich der Strukturen im gedehnten und kontrahierten Zustand konnten die Forscher am Rechner modellieren, wie das T6SS genau funktioniert. «Beim Zusammenziehen der Hülle, verdreht sich Ring für Ring. Dadurch wird der Abstand zum vorherigen Ring kleiner, der Durchmesser nimmt zu und der Speer wird freigelegt», erklärt Basler. «Die Kombination aus Schrumpfen und Drehen führt dazu, dass der Speer ein Loch in die Zielzelle bohrt. Innerhalb von weniger als zwei Millisekunden zieht sich die T6SS-Hülle auf die Hälfte ihrer Länge zusammen und schraubt gleichzeitig den Giftspeer heraus. Die Bakterien verfügen demnach über einen extrem leistungsfähigen Bohrer.»

Nur kontrahierte T6SS-Hülle wird demontiert

Darüber hinaus beschäftigte die Forscher eine weitere Frage. Einige Bakterien verwenden nach dem Abfeuern der Harpune einzelne Bauteile der Hülle für den Bau einer neuen Harpune. «Uns war lange Zeit nicht klar, warum nur die kontrahierte, nicht aber die gedehnte Hüllstruktur demontiert wird», sagt Basler. «Jetzt konnten wir sehen, dass aus der Oberfläche der kontrahierten Hülle ein Proteinabschnitt herausragt, der von einem Protein erkannt wird, der dieses Bauteil in seine Einzelteile zerlegt. Im gedehnten Zustand der Nanoharpune ist dieser Abschnitt jedoch versteckt und die T6SS-Hülle so vor der Demontage geschützt.»

Auch zukünftig soll die Nano-Harpune der Bakterien weiter Gegenstand der Forschung sein. «Eines unserer Projekte widmet sich der Frage, wie das T6SS in der Bakterienhülle befestigt ist. Wenn die Harpune mit so einer Wucht abgefeuert wird, dann muss diese sehr fest verankert sein, ansonsten würde die Waffe nicht einwandfrei funktionieren oder deren Abschuss könnte für den Waffenträger selbst tödlich enden.»

Originalbeitrag:
Jing Wang, Maximilian Brackmann, Daniel Castaño-Díez, Mikhail Kudryashev, Kenneth N. Goldie, Timm Maier, Henning Stahlberg and Marek Basler
Cryo-EM structure of the extended type VI secretion system sheath-tube complex
Nature Microbiology (2017), doi: 10.1038/s41564-017-0020-7

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Markierte Zellen als Fenster in den Körper

Pressemitteilung der Universität Tübingen vom 05.09.2017

Tübinger Forscher entwickeln Verfahren, das Zellen in Mäusen gezielt sichtbar macht und helfen könnte, Tierversuche zu reduzieren

Eine neue und besonders zuverlässige Methode zur Markierung von Zellen kann Forschungen zu Krankheiten wie Herzinfarkt, Diabetes oder Alzheimer vereinfachen und den Einsatz von Versuchstieren reduzieren: Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler der Universität Tübingen haben ein Verfahren entwickelt, mit dem sie bestimmte Zelltypen in Mäusen gezielt markieren und ihr Verhalten durch Positronen-Emissions-Tomografie (PET) verfolgen können. Mit dem „PET-basierten Cell Tracking“ kann man komplexe Lebensprozesse im Körper beobachten, ohne die Versuchstiere mit invasiven Methoden zu belasten.

„Die Möglichkeit, das Verhalten ausgewählter Zellpopulationen im lebenden Tier nichtinvasiv und in Aktion zu beobachten, eröffnet neue Wege für die Erforschung, Erkennung und Behandlung von Krankheiten. Gleichzeitig reduziert sie die Belastung und Anzahl der Versuchstiere gegenüber bisherigen Methoden“, erklärt Professor Robert Feil. Er und sein Team vom Interfakultären Institut für Biochemie (IFIB) der Universität Tübingen führten die Studie gemeinsam mit dem Werner Siemens Imaging Center und den Abteilungen für Kardiologie, Pathologie und Physiologie des Universitätsklinikums Tübingen sowie der Nuklearmedizin des Universitätsklinikums Münster durch. Ihre Ergebnisse wurden nun in der Fachzeitschrift Nature Communications veröffentlicht.

Gewebe und Organe bestehen aus vielen verschiedenen Zelltypen, wie Blut-, Knochen-, Leber-, Muskel- oder Nervenzellen. Die Wanderung und/oder Veränderung der Anzahl bestimmter Zelltypen ist ein normaler Körperprozess, aber auch Merkmal zahlreicher Krankheiten. Zum Beispiel führt die Vermehrung und Migration von Immunzellen zu Entzündungen, unkontrolliertes Zellwachstum löst Krebs oder Arteriosklerose aus und der Verlust bestimmter Zellpopulationen ist die Ursache für Diabetes mellitus oder Alzheimer-Demenz. Diese Vorgänge beruhen auf komplexen Interaktionen verschiedenster Zelltypen. Um sie zu verstehen, muss der gesamte Organismus in den Blick genommen werden.

Die neue Methode „PET-basiertes Cell Tracking“ beruht auf einem künstlichen PET-Reporter-Enzym, das durch einen genetischen Trick in jedem Zelltyp der Maus gebildet werden kann (beispielsweise nur in T-Zellen des Immunsystems). Das Enzym bewirkt, dass sich in diesen spezifischen Zellen eine radioaktive Substanz, der sogenannte PET-Tracer, ansammelt. Die für das Tier ungefährliche radioaktive Strahlung wird in einem Positronen-Emissions-Tomografen erkannt und am Bildschirm sichtbar gemacht. Die PET wird schon lange auch bei Menschen eingesetzt. Als nichtinvasives Verfahren belastet sie den Organismus weniger als viele andere Untersuchungsmöglichkeiten.

Zur Analyse des Zellverhaltens in Mäusen wurden bisher meist Verfahren verwendet, die nur für wenige Zelltypen in Frage kamen, sehr belastende Untersuchungen nötig machten oder die Tötung der Versuchstiere erforderten. „Durch den Einsatz moderner Bildgebungsmethoden können wir eine Verringerung der Versuchstierzahl um bis zu 80 Prozent erreichen“, sagt Dr. Martin Thunemann, Erstautor der Studie, der mittlerweile an der University of California in San Diego forscht. „Die markierten Zellpopulationen können mit unserer Methode nichtinvasiv in lebenden Mäusen über viele Wochen verfolgt werden, sodass die gleiche Gruppe von Tieren wiederholt untersucht werden kann.“ In der Studie markierten die Autoren Blutplättchen, Herzmuskelzellen oder T-Zellen in Versuchsmäusen und verfolgten dann ihr Verhalten bei Herzinfarkt oder Entzündungsreaktionen.

Das neu entwickelte bildgebende Reportersystem könne zur Darstellung jedes beliebigen Zelltyps verwendet und mit beliebigen Krankheitsmodellen kombiniert werden, erklärt Feil. Es komme daher für viele Anwendungen in der biomedizinischen Grundlagenforschung sowie zur Untersuchung von Krankheiten in Frage. „Denkbar ist unter anderem die nichtinvasive Analyse von Herzkrankheiten, Diabetes, Entzündungen sowie Tumorbildung und Metastasierung. Außerdem könnte man in der regenerativen Medizin die Entwicklung transplantierter Zellen verfolgen. Auch für die Pharmaindustrie ist die Technik interessant, um neue Wirkstoffe und Behandlungsmethoden zu testen.“

Die Arbeit der Forscherinnen und Forscher zum „PET-basiertem Cell Tracking“ passt sich in die „Tübinger Grundsätze zu Tierschutz und Tierversuchen“ ein. In ihnen legt die Universität verbindliche Regeln und Zielvorgaben für einen verantwortungsvollen Umgang mit Tierversuchen fest und fördert die Forschung an neuen Methoden. Auch wenn die Alternativen inzwischen erheblich verbessert wurden, können die Lebenswissenschaften in absehbarer Zeit nicht vollständig auf Tierversuche verzichten. Für die Forschung am komplexen Zusammenspiel von Zellen, Geweben und Organen im Gesamtorganismus sowie an neuen Wirkstoffen und Behandlungsmethoden werden weiterhin Tierversuche notwendig sein. Daher ist es wichtig, die Untersuchungsmethoden so zu optimieren, dass die Anzahl und Belastung der Versuchstiere verringert wird. Es müssen Verfahren entwickelt werden, die die Quantität und Qualität der pro Tier erhobenen Daten erhöhen und deren Ergebnisse leicht auf den Menschen übertragbar sind.

Publikation:
Thunemann M, Schörg BF, Feil S, Lin Y, Voelkl J, Golla M, Vachaviolos A, Kohlhofer U, Quintanilla-Martinez L, Olbrich M, Ehrlichmann W, Reischl G, Griessinger CM, Langer HF, Gawaz M, Lang F, Schäfers M, Kneilling M, Pichler BJ, Feil R. Cre/lox-assisted non-invasive in vivo tracking of specific cell populations by positron emission tomography. Nature Communications. 2017; DOI: 10.1038/s41467-017-00482-y

Externer Link: www.uni-tuebingen.de

Hämorrhagische Fieber: Hemmung der Entzündung verhindert Kreislaufkollaps

Medienmitteilung der Universität Basel vom 17.08.2017

Hämorrhagische Fieber sind gefährliche Viruskrankheiten, die oft tödlich ausgehen. Forschende der Universität Basel haben nun Botenstoffe des Immunsystems identifiziert, welche bei infizierten Mäusen zu Schockzuständen führen. Diese Resultate eröffnen neue Möglichkeiten zur Entwicklung von lebensrettenden Therapien. Sie wurden in der Fachzeitschrift Cell Host & Microbe veröffentlicht.

Das Lassavirus aus der Familie der Arenaviren wird von Nagetieren in Westafrika auf den Menschen übertragen und verursacht jährlich mehrere zehntausend Todesfälle durch hämorrhagisches Fieber, ähnlich dem Ebolavirus. Im Endstadium kommt es dabei oft zu Schockzuständen. Die Mechanismen, welche zu tödlichem Kreislaufversagen führen, waren bislang aber nur unzureichend bekannt.

Wie eine Forschergruppe um Prof. Daniel Pinschewer vom Departement Biomedizin der Universität Basel nun berichtet, liegt eine wichtige Ursache des Kreislaufversagens nach Arenavirusinfektionen in der überschiessenden Entzündungsreaktion, welche durch das Virus hervorgerufen wird.

Entscheidende Botenstoffe identifiziert

Bei Virusinfektionen bilden T-Zellen eine zentrale Komponente unserer Körperabwehr. In früheren Arbeiten hatte die Gruppe um Prof. Pinschewer aber herausgefunden, dass die Immunzellen bei der Infektion mit dem Lassavirus paradoxerweise zur Krankheitsentstehung beitragen können. In der vorliegenden Studie wurden nun anhand eines verwandten Arenavirus die zugrundeliegenden Mechanismen entschlüsselt.

Übereifrige T-Zellen stimulieren offenbar Fresszellen dazu, dass sie grosse Mengen von Stickstoffmonoxid (NO) produzieren. Dies ist zwar ein wichtiger Abwehrmechanismus bei bakteriellen Infektionen, hilft aber nicht gegen Viren. Bei Tieren, die mit dem Arenavirus infiziert sind, erweiterte NO aber die Blutgefässe, führte zum Ausschwitzen von Flüssigkeit ins Gewebe und dadurch zur Verminderung des effektiven Blutvolumens und schliesslich zum Kreislaufkollaps.

Wie die Forscher weiter herausfanden, bedarf die NO-Produktion durch Fresszellen des Botenstoffes Interferon-gamma, wie er von T-Zellen produziert wird. Wenn dieser Botenstoff medikamentös blockiert wurde, blieben die Mäuse zwar anfällig für die Virusinfektion, doch erlitten sie keinen Kreislaufkollaps und überlebten weitgehend unbeschadet.

Hoffnung auf neue Therapieansätze

Die Therapiemöglichkeiten bei einer Lassavirus-Infektion und anderen viralen hämorrhagischen Fiebern bleiben unzulänglich. Medikamente zur Blockierung von Interferon-gamma beziehungsweise seiner Wirkung werden im Menschen bereits angewandt. Prof. Pinschewer hofft, dass die Resultate der vorliegenden Studie dazu beitragen werden, diese Medikamente allenfalls erfolgreich zur Behandlung von hämorrhagischem Fieber einzusetzen.

Originalbeitrag:
Melissa M. Remy, Mehmet Sahin, Lukas Flatz, Tommy Regen, Lifen Xu, Mario Kreutzfeldt, Benedict Fallet, Camille Doras, Toni Rieger, Lukas Bestmann, Uwe-Karsten Hanisch, Beat A. Kaufmann, Doron Merkler, Daniel D. Pinschewer
Interferon-γ-Driven iNOS: A Molecular Pathway to Terminal Shock in Arenavirus Hemorrhagic Fever
Cell Host & Microbe (2017), doi: 10.1016/j.chom.2017.07.008

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Im Strom der Bläschen

Presseinformation der LMU München vom 21.07.2017

In Zellvesikeln spielen Ionenkanäle bei zahlreichen Transportvorgängen eine entscheidende Rolle. LMU-Wissenschaftler haben nun eine Methode entwickelt, mit der sie diese molekularen Schleusen spezifischer als bisher untersuchen können.

In Tierzellen bilden kleine Bläschen membranumgebene Vesikel, die als Endo- und Lysosomen bezeichnet werden und an zahlreichen Transportprozessen beteiligt sind. Ionenkanäle, durch die geladene Teilchen durch die Vesikelmembran geschleust werden, nehmen dabei eine Schlüsselposition ein. Defekte in diesem System spielen für die Entstehung zahlreicher Stoffwechselkrankheiten eine wichtige Rolle. Deshalb ist die Entschlüsselung ihrer Funktion auch therapeutisch bedeutsam. PD Christian Grimm und Professor Christian Wahl-Schott vom Department Pharmazie der LMU gehören zu den europaweit führenden Experten für die Untersuchung von endolysosomalen Ionenkanälen mithilfe der sogenannten Patch-Clamp-Technik, die sie in der aktuellen Ausgabe des Fachmagazins Nature Protocols beschreiben. Dem LMU Team ist es am von Professor Martin Biel geleiteten Lehrstuhl für Pharmakologie nun gelungen, die Methode so weiter zu entwickeln, dass spezifisch bestimmte Vesikel analysiert werden können. Dies eröffnet ganz neue Perspektiven, gezielt einzelne Ionenkanäle anzusteuern und zu modifizieren. Über die Weiterentwicklung der Methode berichten die Wissenschaftler in der aktuellen Ausgabe des Journals Cell Chemical Biology.

Das endolysosomale System der Zelle besteht aus sogenannten frühen und späten Endosomen, sowie Recycling-Endosomen und Lysosomen. Die verschiedenen Vesikel-Typen erfüllen unterschiedliche Aufgaben: Frühe Endosomen nehmen in der Nähe der Zellmembran Partikel auf, die dann entweder über die Recycling-Endosomen zurück an die Zellmembran gelangen, oder zu den späten Endosomen und dann zu den Lysosomen transportiert werden, wo sie mithilfe von Enzymen zerlegt werden. Dieses System ist an zahlreichen Stoffwechselprozessen beteiligt und spielt auch bei der Regulierung des Schwermetallhaushalts oder für die korrekte Lokalisation bestimmter Membranrezeptoren eine wichtige Rolle. Dabei sind eine Vielzahl verschiedener Ionenkanäle involviert: „Laut Proteomstudien gibt es bis zu 70 verschiedene Ionenkanal-Transportproteine im Lysosom und Endosom“, sagt Grimm.

Mit der Patch-Clamp-Technik können die Wissenschaftler den Stromfluss durch einzelne Ionenkanäle messen und so feststellen, ob der Kanal aktiv oder inaktiv ist. Dazu saugen die Forscher einen kleinen Membranbereich mit einer Mikropipette leicht an. Mit einer Mikroelektrode legen sie anschließend eine Prüfspannung an und schicken einen Strom durch die Saugelektrode. „Allerdings sind die Vesikel in ihrem ursprünglichen Zustand zu klein, um von der Patch-Pipette erfasst zu werden, deshalb müssen sie vor der Messung vergrößert werden“, sagt Grimm. Die bisherigen pharmakologischen Tools hierfür vergrößerten allerdings unspezifisch alle endolysosomalen Vesikel-Typen. Auf der Suche nach besseren Wirkstoffen screenten die Wissenschaftler verschiedene Substanzen und entdeckten, dass eine bestimmte Kombination zweier Bio-Toxine sehr selektiv nur frühe Endosomen vergrößert, indem diese Vesikel zur Fusion angeregt werden. Außerdem konnten sie zeigen, dass ein weiteres Molekül selektiv nur späte Endosomen und Lysosomen vergrößert, während Recycling-Endosomen von keinem dieser Stoffe beeinflusst werden.

„Das ist ein großer Fortschritt, weil wir nun zwei Toolsets für eine spezifischere Herangehensweise haben und gezielt untersuchen können, welcher Kanal in welchem Vesikel aktiv ist“, sagt Grimm. Mit ihrem neuen Ansatz konnten die Wissenschaftler nachweisen, dass sogenannte TRPML3-Ionenkanäle, die den Kationenhaushalt und den pH-Wert regulieren, sowohl in frühen als auch in späten Endosomen und Lysosomen aktiv sind, während der verwandte TRPML1-Ionenkanal nur in späten Endosomen und Lysosomen, nicht jedoch in frühen Endosomen vorkommt. TRPML-Kanäle spielen bei der Entstehung zahlreicher Krankheiten eine Rolle, etwa bei der Mukolipidose, einer seltenen Stoffwechselkrankheit, die das Nervensystem beeinträchtigt. „Mit unserer weiterentwickelten Technik haben wir erstmals einen selektiven Zugang zu diesen Ionenkanälen. Das ist auch wichtig für mögliche therapeutische Anwendungen, mit denen gezielt bestimmte Kanäle gehemmt werden sollen“, sagt Grimm.

Publikationen:
Nature Protocols 2017
Cell Chemical Biology 2017

Externer Link: www.uni-muenchen.de