Pressemitteilung der Universität Bonn vom 28.05.2009

Forscher verkürzen methodisches Vorgehen zur Suche nach Antitumorwirkstoffen

Wissenschaftler der Universität Bonn haben einen Weg gefunden, marine Schwämme als Quelle pharmakologischer Wirkstoffe zu nutzen. Die Forscher zeigen in einem Paper eine methodische Abkürzung zur Isolierung der notwendigen Gene. Die gewonnen Grundlagen erleichtern eine systematische Suche nach Wirkstoffen gegen Krebs. Ihre Ergebnisse sind nun in der renommierten Fachzeitschrift „Nature Chemical Biology“ veröffentlicht worden.

Die Meere beherbergen die größte Artenvielfalt der Erde. Sie sind daher auch von Bedeutung bei der Suche nach neuen Wirkstoffen zur Arzneimittelgewinnung. Die wichtigste Quelle stellen dabei derzeit marine Schwämme dar. Denn sie produzieren toxische Substanzen zur Verteidigung gegen natürliche Feinde. Eine dieser Substanzen ist Psymberin, ein Wirkstoff, der zur Tumorbekämpfung genutzt werden kann. Für die pharmakologische Nutzung ist allerdings eine Menge notwendig, die über die natürlich vorhandene Menge hinausgeht.

Die Arbeitsgruppe von Professor Dr. Jörn Piel interessiert sich daher für Methoden, mit denen solche Wirkstoffe unter Schonung natürlicher Ressourcen produziert werden können. Viele der Substanzen werden von bakteriellen Symbionten produziert. Diese konnten aber außerhalb ihres Wirtes bisher nicht kultiviert werden. Die Bonner Forscher wandten daher einen Trick an: „Unsere Strategie beruht darauf, Gene, die für die Produktion von Wirkstoffen verantwortlich sind, aus der Gesamt-DNA des Schwamms zu isolieren“, erklärt Professor Piel das Vorgehen seiner Arbeitsgruppe. „Dabei sind dann auch die Erbanlagen der Bakterien, die diese Substanzen im Schwamm produzieren.“

Von dem Institute of Water & Atmospheric Research in Neu Seeland und dem Department of Chemistry and Biochemistry in Santa Cruz bekam die Bonner Arbeitsgruppe die notwendigen Schwämme zur Verfügung gestellt. Doch auch diese Methode stellte die Forschergruppe zunächst vor erhebliche Probleme: „Die Problematik lag in der außerordentlich hohen genetischen Komplexität der Schwämme, da diese hunderte verschiedener bakterieller Arten enthalten können“, so der Bonner Wissenschaftler.

Doch nun konnten die Forscher eine Methode entwickeln, mit der dieses Problem für die Wirkstoffklasse der komplexen Polyketide gelöst werden konnte. Polyketide sind Naturstoffe, die in Schwämmen besonders häufig biologische Aktivität zeigen und somit für eine pharmakologische Nutzung geeignet sind. Zu dieser Klasse gehört auch die Antitumorsubstanz Psymberin. Die Wissenschaftler isolierten zunächst die Gesamt-DNA des Schwamms und seiner Symbionten. Anschließend entfernten sie daraus die Sequenzen, die nicht zur Biosynthese der Polyketide beitragen. Vergleichende Studien an verschiedenen Schwämmen hatten dazu im Vorfeld die nötigen Hinweise ergeben. Die so verringerte Menge der Erbanlagen konnte nun mit diversen Gen-Datenbank abgeglichen und genauer untersucht werden. Dabei zeigte sich, dass durch diese Methode tatsächlich in nur zwei Arbeitsschritten die entscheidende Gen-Sequenz isoliert werden konnte. Das war bisher aufgrund der hohen Komplexität der Gesamt-DNA nicht möglich. Die so gewonnen Gene könnten nun in kultivierbare Bakterien übertragen werden. Damit würden im Idealfall nur wenige Gramm eines Schwamms ausreichen, um einen beliebigen Schwamm-Wirkstoff in großen Mengen zu produzieren.

Damit haben die Bonner Forscher die Grundlage für eine systematische Suche nach wirkstoffproduzierenden Genen geschaffen. So könnte eine allgemeine Lösung des Versorgungsproblems für pharmakologische Naturstoffe erreicht sein. Der letzte Schritt dafür ist die Ausprägung der gewonnenen Gene in kultivierbaren Laborbakterien, an dem die Bonner Wissenschaftler bereits arbeiten.

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Presseinformation der Ruhr-Universität Bochum vom 18.05.2009

JBC: Bochumer Forscher „enttarnen“ Riechrezeptor
Hormonmetaboliten blockieren Zellvermehrung     

Ein Protein mit bislang unbekannter Funktion, das in Prostatakrebszellen massenhaft hergestellt wird, haben Bochumer Biologen um Prof. Dr. Dr. Dr. Hanns Hatt jetzt als Riechrezeptor für Veilchenduft „enttarnt“. Zwar kommt in der Prostata der Blumenduft nicht vor, dafür aber ein sehr ähnlich aufgebautes Molekül als Stoffwechselprodukt des männlichen Sexualhormons Testosteron. Weitere Untersuchungen ergaben, dass dieses Steroidhormon ebenfalls den Riechrezeptor aktivieren kann und der Zelle auf einem neu entdeckten Signalweg das Kommando gibt, die Zellteilung zu stoppen. „Das heißt praktisch, dass man mit Veilchenduft das Prostatakrebswachstum anhalten kann“, spitzt Prof. Hatt die Ergebnisse zu. Weitere Tests sollen zeigen, ob die Erkenntnisse therapeutisch anwendbar sind. Die Studie ist online im Journal of Biological Chemistry veröffentlicht.

Spermien riechen Maiglöckchen, Prostatazellen Veilchen

Nachdem sie bereits Riechrezeptoren für Maiglöckchenduft in menschlichen Spermien nachgewiesen hatten, stießen die Bochumer Forscher jetzt auf einen weiteren dieser Rezeptoren, der auch außerhalb der Nase vorkommt: den Rezeptor für Veilchenduft in Prostatazellen. Um seine Funktion zu ergründen, statteten sie zunächst Nierenzellen mit dem genetischen Bauplan für das Rezeptorprotein aus und konfrontierten sie mit einer komplexen Mischung von Duftstoffen, um festzustellen, welcher von ihnen an den Rezeptor andockt und ihn aktiviert. Die Zellantwort – eine vermehrte Calcium-Ausschüttung – konnten sie mittels Calcium-sensitiven Farbstoffen beobachten. Ergebnis: Der Rezeptor hOR 51 E2 reagierte auf beta- Ionon, den klassischen Veilchenduft, und auf Steroidhormone (z.B. Dihydro-Testosteron), die in ihrer Molekülstruktur Ähnlichkeit mit dem Veilchenduft-Molekül haben. Tests mit gesunden Prostatazellen bestätigten die Ergebnisse, auch sie konnten die Substanzen „riechen“. Die Forscher machten auch die Gegenprobe, indem sie in die Prostatazellen eine Gensequenz einschleusten, die die Rezeptorherstellung unterbindet. Diese Zellen reagierten nicht mehr auf den Duft oder das Steroidhormon.

Zellwachstum nahe Null

„Die Frage war dann natürlich: Welche Funktion hat der Rezeptor in der Prostatazelle? Und welchen Signalweg löst er aus?“, erklärt Prof. Hatt. Die Forscher stießen auf eine ältere Studie, die ein Protein unbekannter Struktur beschrieb, das vor allem in Prostatakrebszellen verstärkt gebildet wird. Bei näherem Hinsehen entpuppte es sich als genau der Veilchenduftrezeptor, den die Bochumer Wissenschaftler untersuchten. Aus der Urologischen Klinik Herne der Ruhr-Universität (Prof. Dr. Joachim Noldus) besorgten sie sich daher aus Operationsmaterial Prostatakarzinomzellen für weitere Untersuchungen. Die Zellantwort auf Veilchenduft oder das Steroidhormon war erwartungsgemäß hoch, da der Rezeptor in großen Mengen vorkommt: Das Zellwachstum nahm signifikant ab und sank gegen Null. Weitere Tests zeigten, dass der Signalweg ein völlig anderer ist als bei Riechzellen. Das Rezeptorsignal wird direkt an den Zellkern übermittelt, der dann dafür sorgt, dass die Zellteilungsrate reduziert wird. Untersuchungen an Mäusen sollen jetzt zeigen, ob das, was in Zellkulturen entdeckt wurde, auch im Organismus funktioniert. „Dann wird man die Erkenntnis irgendwann vielleicht therapeutisch gegen Prostatakrebs einsetzen können“, hofft Prof. Hatt.

Titelaufnahme:
Eva M. Neuhaus, Weiyi Zhang, Lian Gelis, Ying Deng, Joachim Noldus and Hanns Hatt: ACTIVATION OF AN OLFACTORY RECEPTOR INHIBITS PROLIFERATION OF PROSTATE CANCER CELLS. In: The Journal of Biological Chemistry, doi: 10.1074/jbc.M109.012096

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Pressemitteilung der TU München vom 13.05.2009

Forscher der Technischen Universität München konstruieren kelchförmige Proteine für Anwendungen in der Tumortherapie

Kleine, kelchförmige Eiweißstoffe (Lipocaline) in Tränen und Blut schützen uns vor Krankheitskeimen und transportieren Vitamine und Hormone. Forscher der TU München (TUM) und der TUM-Biotech-Ausgründung „Pieris“ haben diese Lipocaline jetzt so verändert, dass sie in der Krebsbehandlung helfen könnten – als Alternative zu den weltweit etablierten therapeutischen Antikörpern. Darüber berichten die Wissenschaftler in den beiden renommierten Zeitschriften „Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A.“ und „Journal of the American Chemical Society“.

Das Spurenelement Eisen ist für fast alle Organismen lebenswichtig. Viele Bakterien legen daher nach einer Infektion eine Art chemischen Miniköder (Siderophor) aus, der Eisen-Ionen in den Körperflüssigkeiten einfängt. Das Immunsystem des Menschen nutzt den Eisenhunger der Bakterien aus, um sich gegen die Erreger zu wehren: Kelchförmige Proteine in Tränen oder Blut, so genannte Lipocaline, fangen die Miniköder zusammen mit dem Eisen ein, so dass die Vermehrung der Keime gebremst wird. Lipocaline erfüllen im Körper aber auch andere Aufgaben: Im Blutstrom transportieren sie zum Beispiel schlecht wasserlösliche Vitamine oder empfindliche Hormone. Jedes Lipocalin erkennt dabei in der Regel nur einen Stoff, den es in seine kelchförmige Bindungstasche aufnimmt.

Forschern um Prof. Arne Skerra vom Wissenschaftszentrum Weihenstephan der TU München ist jetzt zusammen mit Kollegen der Pieris AG (Gründerzentrum IZB in Freising-Weihenstephan) und der Universität York (Großbritannien) ein entscheidender Schritt gelungen, um menschliche Lipocaline als Werkzeuge für die Krebstherapie nutzbar zu machen. Durch Protein-Design und mithilfe der Gentechnik veränderten die Forscher die Kelchstruktur so, dass ein Lipocalin an bestimmte Abwehrzellen binden und dort das Molekül „CTLA-4“ blockieren kann, das in der Immunantwort eine Rolle spielt: Während einer Infektion wird das Immunsystem des Körpers in Alarmzustand versetzt, und CTLA-4 ist dafür verantwortlich, dass die Immunzellen diesen Alarmzustand nach paar Tagen auch wieder beenden. Eine solche Entwarnung ist während einer Immuntherapie gegen Krebs allerdings nicht erwünscht: Hier wird das Abwehrsystem durch eine Art Impfung auf Krebszellen aufmerksam gemacht und soll so lange im Alarmzustand bleiben, bis der Tumor besiegt ist. Derzeit werden therapeutische Antikörper an Patienten getestet, die an CTLA-4 binden und damit die Immunantwort verstärken sollen.

Das neu konstruierte Lipocalin, so fanden Skerra und Kollegen heraus, bindet jedoch genauso wie ein Antikörper an CTLA-4 – daher nennen die Forscher ihre Antikörper-ähnlichen Lipocaline auch „Anticaline“. Anticaline haben gegenüber Antikörpern viele Vorteile: Sie sind achtmal kleiner und können daher leichter in Gewebe-Zwischenräume dringen. Auch die Herstellung von Anticalinen ist weit weniger aufwändig, was für einen pharmazeutischen Herstellungsprozess von großer Bedeutung ist. Und: Anticaline lassen sich über biotechnologische Standardverfahren leicht mit anderen Proteinen zusammenfügen und können diese so mit zusätzlichen biochemischen Funktionen ausstatten.

So verliehen die TUM-Wissenschaftler etwa einem Lipocalin die Eigenschaft, ein kleines Molekül mit einem radioaktiven Metall-Ion (Yttrium) einzufangen. Dieses Anticalin lässt sich in Zukunft zum Beispiel mit einem weiteren Anticalin, das Krebszellen erkennt, verbinden. In einer möglichen Therapie, so sieht es das Konzept vor, erhält der Patient zunächst eine Spritze mit diesem Doppelprotein, das über die Blutbahn zum Tumor gelangt und sich dort anheftet. Der Überschuss der nicht gebundenen Doppelprotein-Moleküle wird durch Leber und Niere abgebaut und ausgeschieden. Danach erst werden dem Patienten die radioaktiven Moleküle gespritzt. Sie werden von dem Doppelprotein eingefangen, das an dem Tumor haftet. Da die radioaktiven Moleküle sehr klein sind, wird der nicht gebundene Überschuss rasch über die Nieren wieder ausgeschieden und kann so im Körper keinen Schaden anrichten. Am Tumor jedoch zerstört die gebundene Radioaktivität die Krebszellen punktgenau.

Ähnliche Konzepte mit doppelt bindenden Strukturen zur Krebsdiagnostik und -therapie werden in der Forschung zwar schon länger verfolgt. Die bisherigen Ansätze verwenden allerdings sehr schwierig herzustellende Antikörper-Konjugate, die chemisch gekoppelt und aufwändig gereinigt werden müssen. „Bislang hat erst eines dieser Konstrukte eine Zulassung als Medikament erhalten“, erklärt Prof. Skerra. „Unser Prinzip der biologischen Fusion eines Anticalins mit einem weiteren Protein ist viel einfacher zu handhaben und kann daher den Sprung von der Forschung in die medizinische Anwendung besser schaffen.“ Der Zukunft der Anticaline sieht Skerra gespannt entgegen: „Wir waren selbst überrascht darüber, welche unterschiedlichen Funktionen Lipocaline durch Protein-Design erfüllen können. Diese bislang wenig beachtete Proteinfamilie hat daher großes Potenzial für die Zukunft.“

Publikationen:

D. Schönfeld, G. Matschiner, L. Chatwell, S. Trentmann, H. Gille, M. Hülsmeyer, N. Brown, P. M. Kaye, S. Schlehuber, A. Hohlbaum, and A. Skerra: An engineered lipocalin specific for CTLA-4 reveals a combining site with structural and conformational features similar to antibodies. Proceedings of the National Adademy of Sciences of the U.S.A. (PNAS), published online before print May 5, 2009, doi:10.1073/pnas.0813399106

Hyun Jin Kim, Andreas Eichinger, Arne Skerra: High-affinity recognition of lanthanide(III) chelate complexes by a reprogrammed human lipocalin 2. Journal of the American Chemical Society (JACS) 2009, 131 (10), 3565-3576.

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Pressemitteilung der Universität Freiburg vom 27.04.2009

Freiburger Biophysiker entwickelt Infrarot-Spektroskopie weiter

Proteine sind die molekularen Maschinen in den Zellen. Um ihre Funktionsweise verstehen zu können, ist es notwendig in sie hineinzusehen und die bei ihrer Arbeit ablaufenden Veränderungen auf einem molekularen Niveau verfolgen zu können. Dies ist möglich mit Hilfe von Infrarotspektroskopie, speziell der so genannten Fourier-Transform Infrarot-Spektroskopie (FTIR), welche die Schwingungen der einzelnen chemischen Bindungen in einem Protein und deren Veränderungen während der Arbeit des Proteins detektieren kann. Ein FTIR-Spektrum eines typischen Proteins setzt sich jedoch aus mehreren 10000 Einzelschwingungen zusammen, so dass es mühsam und oft auch gar nicht möglich ist, die interessierenden Schwingungsbanden zu isolieren und zu identifizieren.

Eine mögliche Lösung dieses Problems ist der Einbau von künstlichen Bausteinen in ein Protein mit speziell auf die spektroskopischen Anforderungen zugeschnittenen Eigenschaften. Die Azidogruppe zum Beispiel besteht aus drei Stickstoffatomen, deren chemische Bindung in einem isolierten spektralen Bereich absorbiert. Dieser Bereich ist nicht von anderen Proteinschwingungen überlagert, und die Azido-Gruppe wäre somit eine für die Spektroskopie ideale Sonde. In einer Zusammenarbeit zwischen Dr. Shixin Ye und Dr. Thomas P. Sakmar von der Rockefeller University in New York und Dr. Reiner Vogel vom Institut für Molekulare Medizin und Zellforschung an der Universität Freiburg ist es nun gelungen, diese Gruppe in den für das Sehen zuständigen Lichtrezeptor Rhodopsin, ein Membran-Protein, an verschiedenen Stellen gezielt einzubauen und ihre Veränderungen bei der Aktivierung des Rezeptors mit FTIR-Spektroskopie im Detail zu verfolgen. Die Wissenschaftler berichten im renommierten Fachjournal Nature Chemical Biology unter dem Titel „FTIR analysis of GPCR activation using azido probes“ über die Ergebnisse ihrer Forschung.

Hierbei wurde eine vor allem von Dr. Peter G. Schultz am Scripps Institute (La Jolla, USA) entwickelte Methode für die Anwendung an der sehr wichtigen Klasse der G Protein-gekoppelten Rezeptoren, zu denen auch das Rhodopsin gehört, erweitert. Während Zellen ihre Proteine normalerweise aus einem begrenzten Repertoire von Bausteinen, den natürlichen Aminosäuren, zusammenbauen, werden sie hier durch molekularbiologische Methoden dazu gebracht, an bestimmten Stellen gezielt eine künstliche Aminosäure einzubauen, welche die oben genannte Azido-Gruppe trägt. Mit dieser Methode konnten erstmals Rezeptoren gewonnen werden, die an für die Aktivierung wichtigen Schaltpunkten des Proteins mit einer Azido-Gruppe markiert waren. FTIR-spektroskopische Untersuchungen ermöglichten es nun, das für die Aktivierung notwendige Aufbrechen und Schließen von elektrostatischen Schaltern innerhalb des Rezeptors durch die spektralen Veränderungen der maßgeschneiderten Sonden zu verfolgen. Diese Methodik ermöglicht somit grundlegende Erkenntnisse zur Funktionsweise dieser Rezeptoren.

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Pressemitteilung der Universität Heidelberg vom 06.04.2009

Neuer Ansatzpunkt für Therapie des AIDS-Erregers? – Heidelberger Virologen veröffentlichen in „Cell Host & Microbe“

Der AIDS-Erreger HIV setzt die Schutzmechanismen menschlicher Zellen gegen Virusinfektionen gezielt außer Gefecht: Ein spezielles Eiweiß des Virus markiert zelluläre Schutz-Proteine für einen zügigen Abbau und vernichtet so den Vorrat der Zelle. Diesen Mechanismus hat ein Heidelberger Wissenschaftlerteam unter Leitung des Virologen Privatdozent Dr. Oliver Keppler erstmals in Zellkulturen nachgewiesen und damit einen neuen Angriffspunkt für Therapien entdeckt.

Eine weitere wichtige Entdeckung der Heidelberger Virologen: Im Rattenmodell für AIDS, mit dem Wissenschaftler Infektion, Krankheitsverlauf und Medikamentenwirkung im Tierversuch untersuchen, greift diese Strategie des HI-Virus nicht. Das Schutz-Protein von Ratten ist immun. HIV kann sich daher in den Versuchstieren nicht so stark vermehren wie im Menschen – eine Schwachstelle des derzeitigen Rattenmodells. Mit dem neuen Wissen wäre es nun allerdings möglich, das Kleintiermodell, das die Heidelberger Wissenschaftler entwickelt haben, gezielt weiter zu verbessern. Die Arbeit wurde im März 2009 in der Fachzeitschrift „Cell Host & Microbe“ veröffentlicht.

Neu gebildete Viren werden abgefangen und an die Zelloberfläche gebunden

Neben dem Immunsystem kann der Körper weitere Schutzmechanismen aktivieren, um Infektionen mit Viren zu bekämpfen oder zu stoppen: Die befallenen Zellen selbst verfügen über eine Reihe von Eiweißen, die verschiedene Schritte der Virusvermehrung behindern. In Gegenwart des Schutz-Proteins CD317 werden neu gebildete Viren beim Verlassen der Zelle fest an die Zelloberfläche gebunden und dies behindert sie am Befall weiterer Körperzellen. HIV überwindet diese Blockade mit seinem Protein Vpu: Es setzt diesen Schutzmechanismus, der interessanterweise gegen eine Vielzahl von Virenarten wirkt, gezielt außer Kraft.

Das Virologenteam um Dr. Keppler aus der Abteilung Virologie des Hygiene-Instituts am Universitätsklinikum Heidelberg (Ärztlicher Direktor: Professor Dr. Hans-Georg Kräusslich) untersuchte, auf welche Weise Vpu das Schutz-Protein CD317 in seiner Wirkung stört. Sie stellten fest, dass in menschlichen Zellen, in denen nach HIV-Befall der Störfaktor Vpu gebildet wird, der Vorrat an CD317 auf rund ein Viertel der ursprünglichen Menge zusammenschrumpft. „In Anwesenheit von Vpu wird CD317 von einem zelleigenen System zügig abgebaut. Vermutlich bindet Vpu an CD317 und markiert es für eine schnelle Beseitigung“, erklärt Dr. Keppler.

Je weniger CD317 in der Zelle vorhanden ist, desto mehr Viren können der Abfangvorrichtung entkommen. „Diese Interaktion zwischen Vpu und CD317 zu stören, wäre daher ein vielversprechender therapeutischer Ansatz, um die zelleigenen Schutzmechanismen zu stärken“, so Dr. Keppler.

Auch Ratten und Mäuse verfügen über dieses Schutz-Protein. Es übernimmt dieselbe Funktion und ist in der Lage, das HI-Virus des Menschen zu blockieren. Es gibt allerdings einen wichtigen Unterschied: Die Heidelberger Virologen entdeckten, dass Vpu dem CD317 in Rattenzellen nichts anhaben kann. „Das HI-Virus ist auf den Menschen spezialisiert, der Störmechanismus durch Vpu kann daher gegen den tierischen Infektionsschutz nichts ausrichten“, sagt Dr. Christine Goffinet, Erstautorin der Studie.

Ratten-Tiermodell soll nun verbessert werden

Dieses Detail ist wichtig, wenn die HIV-Infektion im Tiermodell an Ratten nachgestellt und untersucht werden soll: Die Infektion nimmt in der Ratte nicht denselben Verlauf wie im Menschen, da wegen der intakten zellulären Schutzvorrichtungen deutlich weniger Viren freigesetzt werden. Dank der neuen Forschungsergebnisse hoffen die Heidelberger Wissenschaftler nun, das Tiermodell zu verbessern. Ziel ist es, in den Ratten CD317 gentechnisch auszuschalten und somit einen Grad der HIV-Infektion zu erzielen, der dem des Menschen ähnlicher ist.

Bereits 2007 war es den Heidelberger Wissenschaftlern gelungen, Ratten durch gezielte Veränderung ihres Erbmaterials erstmals für eine Infektion mit HIV empfänglich zu machen. An diesen „transgenen“ Ratten testeten sie erfolgreich Medikamente gegen die HIV-Infektion beim Menschen. Mit diesem transgenen Kleintiermodell ist es möglich, die Wirksamkeit von Medikamenten gegen den AIDS-Erreger HIV schnell und in größerem Umfang vor ihrem Einsatz beim Menschen zu prüfen und so die Weiterentwicklung neuer Virostatika zu beschleunigen.

Literatur:
Christine Goffinet, Hans-Georg Kräusslich, and Oliver T. Keppler: HIV-1 Antagonism of CD317 Is Species Specific and Involves Vpu-Mediated Proteasomal Degradation of the Restriction Factor. Cell Host & Microbe 5, 285-297, March 19, 2009. DOI 10.1016/j.chom.2009.01.009

Externer Link: www.uni-heidelberg.de